光学显微镜对焦时的注意事项主要包括以下几点：

初始对焦：

在初次使用显微镜时，需要先进行初始对焦。这通常是通过粗调焦机构将物镜移动到离标本较远的位置，然后通过目镜调焦机构将孔径调小。

接着，可以通过粗调焦机构把物镜逐渐移动到与标本的表面接触，并继续观察目镜中的图像。若图像尚未清晰，而且对焦机构已经到达极限，可以尝试将标本向上或向下移动，直到图像变得清晰锐利。

调整聚光：

聚光是控制样品表面与物镜之间距离的过程，也是控制样品与暗场光源的距离。这个距离的改变直接影响着显微镜观察的清晰度。

在调整聚光的过程中，需要逐渐减小孔径，以增加深度聚焦的范围。特别是在观察比较厚的样品时，需要通过调整聚光来改变光线的入射角度，从而获得Z优的对焦图像。

微调对焦：

当初次对焦完成后，需要进行微调对焦以获得更清晰的图像。这主要通过物镜调焦机构来完成，需要慢慢地向前或向后旋转物镜调焦机构，从而微调样品与显微镜镜头的距离。

当图像变得更清晰时，可以通过适当的微调向前或向后移动标本，直到获得Z佳的对焦结果。

避免振动：

对焦过程中需要尽量保证显微镜稳定，避免振动影响图像清晰度。

可以通过使用显微镜的多点支撑、放置在坚实的桌子上、减小观察时的呼吸频率等措施来减少机械振动。

注意物镜和标本的距离：

在调焦时，要注意物镜和标本之间的距离，避免物镜直接接触到标本，以免损伤标本或物镜。

特别是在使用高倍物镜时，要特别小心，因为此时物镜与标本之间的距离非常近，稍有不慎就可能造成损伤。

选择合适的调焦手轮：

在对焦过程中，应根据需要选择合适的调焦手轮。一般来说，粗调焦手轮用于快速调整焦距，而细调焦手轮则用于精确调整焦距。

在使用高倍物镜时，应避免使用粗调焦手轮，以免移动距离过大而损伤物镜和玻片。

观察并调整图像：

在对焦过程中，要密切观察目镜中的图像变化，并根据需要进行调整。

如果图像不清晰或存在其他问题，可以尝试调整光源、光圈、反光镜等部件，以获得更好的观察效果。

综上所述，光学显微镜对焦时需要注意多个方面，包括初始对焦、调整聚光、微调对焦、避免振动、注意物镜和标本的距离、选择合适的调焦手轮以及观察并调整图像等。只有掌握了这些注意事项并正确操作显微镜，才能获得清晰的图像以及更加精确的观测结果。